Wykrywanie DNA Borrelia burgdorferi metodą reakcji łańcuchowej polimerazy w mazi stawowej od pacjentów z boreliozą cd

Reakcje amplifikacji, które przeprowadzono w termocyklerze (Perkin-Elmer Cetus) przechowywanym w oddzielnym laboratorium, składały się z 45 cykli denaturacji w 94 ° C przez 45 sekund, hybrydyzacji w temperaturze 50 ° C przez 45 sekund i wydłużania w 72 ° C przez minutę. Cykle były poprzedzone czterominutową fazą w 94 ° C, a następnie końcową siedmiominutową fazą wydłużania w temperaturze 72 ° C. Po amplifikacji próbki natychmiast eksponowano na 20 mW światła 300 do 400 nm na centymetr kwadratowy przez 20 minut w celu inaktywacji produktów i przechowywano w temperaturze -20 ° C. Próbki kontrolne dołączone do każdego testu amplifikacji obejmowały próbki z DNA wyekstrahowanym od pacjentów kontrolnych, trzy puste próbki kontrolne z 5 mikrolitrami wody podstawionej dla DNA i próbkę kontroli pozytywnej z 60 .g całkowitego DNA B. burgdorferi (szczep 297). Produkty amplifikacji przechowywano i analizowano w oddzielnym obszarze, a pipety o dodatnim przemieszczeniu z jednorazowymi tłokami stosowano do przygotowania wszystkich odczynników PCR.
Produkty amplifikowane (5 mikrolitrów) rozdzielono za pomocą 4% elektroforezy w żelu agarozowym (3% NuSieve i 1% SeaKem, FMC Corporation, Rockland, Me.) Przy 35 do 100 V przez jedną do trzech godzin. Żel następnie wybarwiono bromkiem etydyny i wizualizowano, przemyto wodą, przemyto w roztworze denaturującym (1,5 M chlorek sodu i 0,5 M wodorotlenek sodu) przez 45 minut, przemyto ponownie wodą, przemyto roztworem neutralizującym (1,5 M chlorek sodu i 0,5 M TRIS [pH 7,5]) i osuszono. Blotting przeprowadzono przez noc na membranie nylonowej (Hybond-N, Amersham, Arlington Heights, IL) z 0,15 M chlorkiem sodu i 0,015 M cytrynianem sodu (SSC). Membranę usieciowano 0,12 J światła ultrafioletowego.
Błony przepłukano w płynie do hybrydyzacji (5x roztwór Denhardta [1x roztwór Denhardta to 0,02% Ficoll, 0,02% poliwinylopirolidon i 0,02% albumina surowicy bydlęcej], 0,75 M chlorek sodu, 0,025 M fosforan sodu, 0,005 M tetraoctan etylenodiaminy, 0,5% dodecyl sodu siarczan i 100 .g zdenaturowanego DNA plemników łososia na mikrolitr) przez cztery godziny w 55 ° C. Następnie dodano sondę oligonukleotydową znakowaną końcowo fosforem-32 przez 15 do 17 godzin w 55 ° C. Po hybrydyzacji błony przemywano 2x SSC i 0,1% dodecylosiarczanu sodu przez 10 minut, x SSC i 0,1% dodecylosiarczanu sodu przez 20 minut, i 0,2 x SSC i 0,1% dodecylosiarczanu sodu przez 30 minut. Na koniec membrany eksponowano na błonę Kodak XAR-5 przez 4 do 72 godzin w temperaturze -70 ° C. Alternatywnie, produkty amplifikacji wykrywano za pomocą sondy chemiluminescencyjnej, jak opisano w innym miejscu37. Prążki DNA były rzadko widywane na żelach barwionych etidium; próbki uznano zatem za pozytywne na podstawie wykrywania sygnału po hybrydyzacji.
Testy hamowania
Początkowe próbki od każdego pacjenta z zapaleniem stawów z Lyme, w których nie wykryto DNA B. burgdorferi, a 62 z 69 próbek kontrolnych testowano pod kątem obecności inhibitorów PCR. Do każdej próbki dodano 1000 kopii (oznaczonej przez seryjne rozcieńczenie) produktu amplifikacji OspA2-OspA4 wytworzonego bez sieciowania izopsoralenowego, a następnie amplifikowano za pomocą starterów OspA2 i OspA4.
[więcej w: nfz wrocław sanatoria lista oczekujących, thermolifting zaffiro, nfz lublin sanatoria lista oczekujących ]