Wykrywanie DNA Borrelia burgdorferi metodą reakcji łańcuchowej polimerazy w mazi stawowej od pacjentów z boreliozą ad

Próbki płynu maziowego podzielono na wiele porcji i zamrożono w -70 ° C; w większości przypadków próbka użyta do testu PCR nie została otwarta przed tym badaniem. Próbki od 37 pacjentów zebrano w heparynie, znanym inhibitorze amplifikacji PCR34; próbki te zostały wyłączone z badania. Pojedyncze próbki badano u 61 z pozostałych 90 pacjentów, a dwie do pięciu próbek seryjnych testowano w 29. Dane kliniczne zebrane z wykresów pacjentów z boreliozowym zapaleniem stawów analizowano bez znajomości wyników testów PCR. W tym samym 17-letnim okresie płyn maziowy uzyskano również od 69 pacjentów z grupy kontrolnej z innymi postaciami zapalenia stawów. Siedemnaście z tych próbek pobrano, przetworzono i przechowywano w ten sam sposób, jak te od pacjentów z boreliozowym zapaleniem stawów. Wśród pacjentów kontrolnych 20 miało reumatoidalne zapalenie stawów; 7 każdy miał podagrę, zapalenie kości i stawów i degeneracyjną chorobę stawów; 5 miało młodzieńcze reumatoidalne zapalenie stawów; 2 każdy miał rzekome, łuszczycowe zapalenie stawów, twardzinę, spondyloartropatię i zespół Reitera; a 13 miało inne formy zapalenia stawów. Test PCR
Próbki mazi stawowej od pacjentów z chorobą i kontrolą poddano ślepocie w dwóch oddzielnych laboratoriach zgodnie z poniższym protokołem. DNA wyizolowano ze 100 do 200 mikrolitrów mazi stawowej za pomocą dostępnego w handlu zestawu (Isoquick, Microprobe, Bothell, Wash.) Zgodnie ze specyfikacjami producenta, zmodyfikowanego przez dodanie 20 .g glikogenu do każdej próbki jako nośnika podczas wytrącania izopropanolu. . Przy każdej ekstrakcji DNA pobierano próbki mazi stawowej od pacjentów z chorobą i kontrolną jednocześnie. Do przygotowania wszystkich próbek użyto końcówek pipet z filtrem i dedykowanego zestawu pipet.
Tabela 1. Tabela 1. Sekwencje startera i sondy oligonukleotydowej. Trzy oddzielne regiony genomu B. burgdorferi były celem amplifikacji PCR przez cztery zestawy starterów i sond (Tabela 1). Ustawia 1, 2 i 3 ukierunkowane części genu plazmidu B. burgdorferi kodującego OspA, a zestaw 4 jest ukierunkowany na część chromosomalnego DNA kodującego 16S rybosomalny RNA35. Zestawy 2 i 3 były ukierunkowane na tę samą sekwencję genu OspA w celu amplifikacji, ale do wykrywania wykorzystano różne sondy wewnętrzne.
Primery i sondy zsyntetyzowano na syntezatorze oligonukleotydowym (Applied Biosystems, Foster City, CA), odsalano na kartridżu do oczyszczania oligonukleotydów (Glen Research, Sterling, VA) i stosowano bez dalszego oczyszczania. Całkowity DNA rozpuszczono w 30 mikrolitrach wody; 5 mikrolitrów tego roztworu dodano do mieszaniny PCR zawierającej 50 pM każdego startera (końcowe stężenie, 1,0 mikroM), 200 mikro M każdego trifosforanu deoksynukleozydu, 10 mM chlorowodorek TRIS (pH 8,3), 50 mM chlorek potasu, 17,5 mM chlorek magnezu, 0,01 .g albuminy surowicy bydlęcej na mikrolitr, 10% glicerolu, 0,5% Tween-20 i 1,25 jednostki polimerazy Taq (Amplitaq, Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, Conn.). Pięć mikrogramów isopsoralenu dodano do mieszaniny PCR w celu inaktywacji produktów po amplifikacji, 36 i całkowitą objętość doprowadzono do 50 mikrolitrów za pomocą wody. Na mieszaninę nałożono jedną kroplę oleju mineralnego
[hasła pokrewne: przeglądarka skierowań do sanatorium, wiedźmin 3 edycja kolekcjonerska allegro, imikwimod ]