Nieprawidłowości transkrypcji PIG-A w granulocytach od pacjentów z napadową nocną hemoglobinurią

Napadowa nocna hemoglobinuria (PNH) to nabyte zaburzenie komórek krwi, w którym zaatakowane komórki pochodzą z nieprawidłowej hematopoetycznej komórki macierzystej; schorzenie charakteryzuje się nocną hemoglobinurią, przewlekłą niedokrwistością hemolityczną i zakrzepicą1,2. Hemoliza z udziałem dopełniacza jest główną cechą tej choroby i wynika z niedoboru ekspresji czynnika przyspieszającego rozkład (CD55) i CD59 na powierzchni komórki, które chronią komórki krwi przed działaniem dopełniacza3. Podstawową przyczyną tych niedoborów jest wadliwa synteza cząsteczek glikozylo-fosfatydyloinozytolu, które zakotwiczają te i wiele innych białek w błonie komórkowej4,5. Pokazaliśmy, że linie komórkowe od dwóch pacjentów z PNH i chemicznie indukowanej zmutowanej linii komórkowej z niedoborem glikozylo-fosfatydyloinozytolu mają ten sam wadliwy gen6. Nazwaliśmy ten gen PIG-A dla klasy A glikanu fosfatydyloinozytolowego, ponieważ mutant należał do klasy A grup komplementujących zmutowane komórki z niedoborem glikozylo-fosfatydyloinozytolu7. Wyizolowaliśmy jego komplementarny DNA (cDNA) i odkryliśmy, że uczestniczy on w syntezie pierwszego związku pośredniego w biosyntezie glikozylo-fosfatydyloinozytolu7. Niedawno odkryliśmy, że cDNA PIG-A koryguje niedobór fenotypu linii komórkowych dotkniętych PNH i zidentyfikowaliśmy mutację somatyczną, która spowodowała utratę funkcji PIG-A u jednego pacjenta8. Lokalizacja genu PIG-A na chromosomie X stanowiła fenotypową ekspresję tej mutacji8.
W tym badaniu wykorzystaliśmy granulocyty z krwi obwodowej lub szpiku kostnego uzyskane od 15 pacjentów, aby przeanalizować strukturę i funkcję przekaźnikowego RNA (mRNA) PIG-A u pacjentów z PNH. Fluorocytowa cytometria przepływowa aktywowana fluorescencyjnie ujawniła granulocyty z niedoborem powierzchniowej ekspresji białek zakotwiczonych przez glikozylo-fosfatydyloinozytol. MRI wirusa PIG-A z granulocytów dotkniętych PNH poddano odwrotnej transkrypcji, a powstały cDNA zamplifikowano za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), a następnie sklonowano. Strukturę cDNA analizowano za pomocą elektroforezy żelowej i sekwencjonowania nukleotydów; ocena funkcji opierała się na zdolności cDNA do korygowania fenotypu linii komórkowej z niedoborem PIG-A po transfekcji. Nieprawidłowości w transkrypcjach mRNA PIG-A stwierdzono u wszystkich 15 pacjentów. Wnioskujemy, że PIG-A jest genem odpowiedzialnym za przyczynową mutację somatyczną u większości, jeśli nie u wszystkich pacjentów z PNH.
Metody
Pacjenci i próbki krwi
Przebadaliśmy próbki krwi od 15 japońskich pacjentów z PNH. Wszyscy pacjenci mieli pozytywny test Ham a, który wykrywa erytrocyty nienaturalnie wrażliwe na dopełniacz. Jeden pacjent (pacjent 12) miał niedokrwistość aplastyczną, ale inni pacjenci nie mieli innych zaburzeń hematologicznych. Za świadomą zgodą pacjentów pobrano próbki krwi obwodowej, którym podawano heparynę lub komórki szpiku kostnego. Granulocyty izolowano z krwi po wyeliminowaniu innych typów komórek przez sedymentację w wirówce 6% dekstranu i Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Uppsala, Szwecja). Dodatkowy pacjent, pacjent 16 i linia komórek B-limfoblastoidalnych ustalona od Pacjenta 16 zostały opisane w innym miejscu9.
Aktywowana fluorescencją cytometria przepływowa
Komórki wybarwiono na CD55 i CD59 biotynylowanymi IA1010 i 5H8 (prezent od Drs
[więcej w: nfzlublin, usg brzucha szczecin, pediatra pruszków ]