Nieprawidłowości transkrypcji PIG-A w granulocytach od pacjentów z napadową nocną hemoglobinurią czesc 4

Ta delecja 207 pz była taka sama jak w dotkniętych komórkach od Pacjenta 16,8 i odpowiadała całemu eksonowi 8. Pacjent 2 był mężczyzną, więc nie było normalnego allelu PIG-A. Pacjent miał również duży, nienormalny prążek około 1400 bp (Figura 1B, ścieżka 1) i niewiele normalnego pasma 1500 bp. Ponieważ u tego pacjenta występowały tylko granulocyty z niedoborem CD59 (tabela 1), nieprawidłowe pasmo musiało pochodzić z tych granulocytów. Analiza sekwencji sklonowanego produktu wykazała delecja 133 bp od pozycji 849 do pozycji 981 (figura 2), co spowodowałoby przesunięcie ramki i pojawienie się kodonu stop (TAA). Ten 133-parowy region odpowiada całemu eksonowi (dane niepublikowane). Ten pacjent był samicą, więc aktywny chromosom X musi zawierać dotknięty gen PIG-A.
Produkty odwrotnej transkrypcji i PCR od Pacjenta 14 (Figura 1C, ścieżka 14) wykazały intensywne pasmo przy 850 bp i słabsze prążki przy 1500 bp i 1200 bp. Ten wzór, wraz ze znalezieniem za pomocą cytometrii przepływowej, że 43 procent granulocytów wykazywały niedobór CD59, wskazywał, że prążek o wielkości 850 bp był głównym produktem dotkniętych komórek i że wzór transkryptów PIG-A był zniekształcony. Delecja 658 pz w produkcie o wielkości 850 pz powoduje przesunięcie ramki i pojawienie się kodonu stop (TAA) w dół.
Transfekcja tych trzech typów cDNA PIG-A z delecjami do komórek JY5 z niedoborem PIG-A nie przywróciła ekspresji powierzchniowej CD59 (Tabela 1), potwierdzając, że trzy typy cDNA są niefunkcjonalne.
Mutacje punktowe
W celu określenia funkcji normalnych wielkości produktów PIG-A odwrotnej transkrypcji i PCR (Figura 1B i Figura 1C, ścieżki 3 do 13), transfekowaliśmy sklonowane produkty do komórek JY5 z niedoborem PIG-A i testowano na komplementację niedobór fenotypu. Z 20 niezależnych klonów cDNA otrzymanych od Pacjenta 11, 5 przywróciło niedoborową ekspresję powierzchni CD59 do normy. Piętnaście klonów (75 procent) nie miało jednak proporcji zgodnej z odsetkiem niedoboru granulocytów (83 procent) u tego pacjenta (tabela 1). U Pacjenta 9, u którego 95% granulocytów miało niedobór CD55 i CD59, wszystkie 20 klonów nie przywróciło defektu w komórkach JY5 (Tabela 1). Sugerujemy zatem, że niektóre zmiany w sekwencjach nukleotydowych skutkowały niefunkcjonalnym mRNA PIG-A.
Rysunek 3. Rysunek 3. Mutacje punktowe mRNA PIG-A w granulocytach od dwóch pacjentów z PNH. Panel A pokazuje sekwencje nukleotydowe części mRNA, które zawierają mutację w Pacjentach 11 i 9, z odpowiednimi normalnymi sekwencjami pokazanymi poniżej. Pokazano miejsca endonukleaz restrykcyjnych, a poziome strzałki wskazują startery PCR. Panel B pokazuje wrażliwość produktów PCR na trawienie przez restrykcyjne endonukleazy. Produkty PCR od Pacjenta 11, zamplifikowane ze starterami A2 i B3 oraz od Pacjenta 9, zamplifikowane ze starterami A1 i B3, strawiono odpowiednio NlaIII i Hpal. Substancje trawiące rozdzielono przez elektroforezę w 8% żelu akryloamidowym i wybarwiono bromkiem etydyny. Zastosowane szablony zawierały sklonowane produkty PCR o aktywności funkcjonalnej (ścieżka 1), klonowane produkty bez aktywności (ścieżki 2 i 5), wszystkie produkty PCR (ścieżki 3 i 6) i autentyczne cDNA dla PIG-A (linia 4).
Aby to potwierdzić, określiliśmy sekwencje nukleotydowe klonów cDNA z Pacjentów 9 i 11
[podobne: dna moczanowa objawy zdjecia, nfz lublin sanatoria lista oczekujących, nfz przeglądarka skierowań do sanatorium ]