Nieprawidłowości transkrypcji PIG-A w granulocytach od pacjentów z napadową nocną hemoglobinurią cd

Po 10 dniach hodowli i selekcji z 400 .g higromycyny B na mililitr, transfekowane komórki barwiono na CD55 i CD59 i badano za pomocą cytometrii przepływowej. Sekwencjonowanie nukleotydów
Obie nici klonowanych produktów odwrotnej transkrypcji i PCR sekwencjonowano zestawem barwnika-terminatora i automatycznym sekwenatorem DNA (Applied Biosystems, Foster City, CA). Dziesięć klonów od każdego pacjenta zsekwencjonowano, a mutacje potwierdzono przez sekwencjonowanie klonów uzyskanych z drugiej amplifikacji PCR.
Wyniki
Tabela 1. Tabela 1. Wyniki analiz mRNA PIG-A u pacjentów z PNH. Wszystkich 15 badanych pacjentów miało erytrocyty i granulocyty z niedoborem CD55 i CD59 (Tabela 1). Próbowaliśmy ustalić, czy było to spowodowane nieprawidłowościami w genie PIG-A. Region kodujący transkrypty PIG-A z granulocytów amplifikowano przez odwrotną transkrypcję i PCR (Figura 1A). RNA z granulocytów zdrowych osobników dało trzy produkty amplifikacji (Figura 1D, ścieżki N1 i N2). Największy prążek (1500 par zasad [bp]) zawierał cały region kodujący i był dopasowany do produktu amplifikacji z autentycznego cDNA PIG-A (figura 1B, linia M). Drugi i trzeci największy prążek (odpowiednio 1200 bp i 850 bp) miał delecję 374 bp z nukleotydu 342 do nukleotydu 715 i delecję 658 bp z nukleotydu 58 do nukleotydu 715. Te krótsze transkrypty były prawdopodobnie wytwarzane przez alternatywne składanie, ponieważ usunięte regiony, które znajdują się w eksonie, miały potencjalne miejsca 5 -splicingowe (dinukleotyd guanozynowo-tyminowy [GT]) na ich końcach 5 i ponieważ ich końce 3 (w pozycji 715) odpowiadają 3 koniec eksonu.
Większość produktów otrzymanych z granulocytów dotkniętych PNH przez odwrotną transkrypcję i PCR miała normalną wielkość i obfitość (Figura 1B i Figura 1C, ścieżki 3 do 13), ale produkty od dwóch pacjentów (Pacjenci i 2, Figura 1B, ścieżki i 2) miały nienormalną wielkość. U jednego pacjenta (pacjent 14, figura 1C, ścieżka 14), stosunki między trzema produktami amplifikacji były wysoce wypaczone.
Nieprawidłowości w rozmiarze
Rysunek 2. Figura 2. Zmiany w mRNA PIG-A w granulocytach od trzech pacjentów z PNH. Każdy panel pokazuje region kodujący cDNA PIG-A, z numerami nukleotydów, miejscami endonukleazy restrykcyjnej i odpowiednim regionem wskazanej sekwencji nukleotydowej. Regiony niezacienione w cDNA i oznaczone strzałkami w sekwencjach zostały splicowane. Małe pionowe paski oznaczają normalne ramki odczytu. Zatrzymane kodony generowane przez przesunięcie ramki są podkreślone. H oznacza Hindlll, S SalI, P PstI, RI EcoRI i RV EcoRV.
Produkty odwrotnej transkrypcji i PCR od Pacjenta 2 (Figura 1B, ścieżka 2) składały się z głównego pasma o wielkości około 1300 bp i kilku mniejszych pasm, ale tylko o bardzo małej ilości normalnego pasma 1500 bp. Ponieważ 90 procent granulocytów u tego pacjenta wykazywało niedobór CD59 (Tabela 1), pasmo 1300 bp musiało pochodzić z dotkniętych granulocytów. Sklonowaliśmy ten produkt i określiliśmy jego sekwencję nukleotydową. Miał delecję 207 pz od pozycji 982 do pozycji 1188 (Figura 2), co skutkowałoby niefunkcjonalnym białkiem z delecją 69 aminokwasów.
[więcej w: thermolifting zaffiro, wiedźmin 3 edycja kolekcjonerska allegro, nfz wrocław sanatoria lista oczekujących ]