Nieprawidłowości transkrypcji PIG-A w granulocytach od pacjentów z napadową nocną hemoglobinurią ad 5

Wszystkie 10 klonów niefunkcjonalnego cDNA PIG-A od Pacjenta 11 miało delecję jednej zasady (tyminy) w pozycji 408 (Figura 3A); ta mutacja nie została znaleziona w funkcjonalnych klonach cDNA PIG-A od tego pacjenta lub od osób zdrowych. Delecja tyminy powoduje przesunięcie ramki i kodon stopu (TAA) o 106 pz w dół. Ponieważ ta delecja eliminuje miejsce restrykcyjne NIII, produkty PCR od Pacjenta 11, które amplifikowano ze starterami A2 i B3, trawiono NlaIII (Figura 3B). Produkt pochodzący z funkcjonalnego klonu cDNA PIG-A od tego pacjenta (Figura 3B, ścieżka 1) był wrażliwy na NlaIII, podczas gdy ten z niefunkcjonalnego klonu (Figura 3B, ścieżka 2) nie był. Ogólnie, produkty PCR amplifikowane z RNA z odwrotną transkrypcją z granulocytów tego pacjenta były częściowo wrażliwe na NlaIII (Figura 3B, ścieżka 3). Pozorny stosunek frakcji niewrażliwej na wrażliwą wynosił około 3 do 1, proporcja zgodna z wynikami analiz cytometrii przepływowej i transfekcji, które wykazały odpowiednio, że 83 procent granulocytów miało niedobór CD59 i że 75 procent klonowany cDNA był niefunkcjonalny. W Pacjent 9 wszystkie 10 klonów niefunkcjonalnego cDNA PIG-A miały wstawienie jednej zasady (adeniny) między pozycjami 245 i 246 (Figura 3A). Ponieważ ta insercja adeniny generuje kodon stop (TAA) i tworzy nowe miejsce restrykcyjne Hpal, produkty PCR od pacjenta 9 amplifikowane ze starterami A1 i B3 były trawione Hpal (Figura 3B). Produkt PCR z niefunkcjonalnego klonu cDNA PIG-A był wrażliwy na Hpal (Figura 3B, ścieżka 5), podczas gdy ten z autentycznego cDNA dla PIG-A (Figura 3B, ścieżka 4) nie był. Prawie wszystkie produkty PCR amplifikowane z RNA z granulocytów tego pacjenta, które poddano odwrotnej transkrypcji, były wrażliwe na HpaI (Figura 3B, ścieżka 6), wynik zgodny z analizami za pomocą cytometrii przepływowej i transfekcji.
Figura 4. Figura 4. Korelacja między procentem niedoboru granulocytów w CD59 lub CD55, jak określono za pomocą cytometrii przepływowej, a procentem niefunkcjonalnych klonów produktów PCR PIG-A. Trójkąty oznaczają normalne przedmioty.
Przeprowadzono również transfekcje z próbkami od dziewięciu innych pacjentów o prawidłowych wzorach, gdy analizowano je za pomocą odwrotnej transkrypcji i PCR (Figura 1B). U wszystkich tych pacjentów wykryliśmy wyższy odsetek niefunkcjonalnych klonów PIG-A niż u zdrowych osób (tabela 1). Korelacja między odsetkiem niefunkcjonalnych klonów i granulocytów z niedoborem CD55 lub CD59 była istotna (P <0,001) (Figura 4), co sugeruje, że niefunkcjonalny mRNA PIG-A pochodzi z dotkniętych granulocytów. Dwadzieścia procent klonów pochodzących z granulocytów uzyskanych od normalnych osobników nie funkcjonowało (Tabela 1). Przyczyna tego jest nieznana, ale albo wynika to z eksperymentalnego artefaktu, takiego jak błąd w technice PCR, albo ułamek normalnych transkryptów PIG-A może być nieprawidłowy.
Ilościowa nieprawidłowość w amplifikacji transkryptów PIG-A
Figura 5. Figura 5. Analiza mRNA PIG-A w granulocytach od Pacjenta 15 i podmiotu normalnego. RNA poddano odwrotnej transkrypcji losowymi starterami i uformowano w szablony
[podobne: usg brzucha szczecin, luka anionowa, thermolifting zaffiro ]